为了研究肌肉疾病，科学家们把小鼠作为一种模式生物。巴塞尔大学的研究人员现在开发了一种新方法，不仅比传统方法更快、更有效，而且大大减少了研究肌肉纤维中基因功能所需的实验动物数量。
图片来源：巴赛尔大学提供。
使用AAV-CRISPR/Cas9在成年小鼠骨骼肌纤维中快速，可重复和有效地敲除体细胞基因
研究人员使用小鼠作为模型生物来研究骨骼肌的结构和功能、神经肌肉疾病和肌肉老化过程。科学家们意识到他们在使用动物方面的责任，并在巴塞尔大学承诺在动物辅助研究和畜牧业中严格执行所谓的3R原则——替代(Replacement)、减少(Reduction)、改进(refine)。
这项新方法是由巴塞尔大学生物中心的Markus r
研究肌肉纤维基因的困难
研究肌肉中的基因功能具有挑战性。一方面，肌肉纤维非常大，孤立时非常脆弱。另一方面，在人类中，它们长达半米，含有数千个细胞核。为了改变和研究肌纤维中的基因功能，必须改变所有的肌纤维核，这是很难实现的。
多年来，科学家们一直在使用CRISPR/Cas9方法来研究基因功能。这种方法使用一种病毒将所谓的Cas9蛋白和一种专门设计的引导RNA引入生物体，从而进入细胞核。Cas9蛋白在向导RNA识别的位点切割基因组DNA。这种Cas9蛋白和引导RNA的结合允许改变细胞中的基因功能。
CRISPR-Cas9方法可以拆分
然而，为了确保病毒只改变肌肉纤维的基因表达，而不是同时改变其他器官的基因表达，研究小组将CRISPR/Cas9方法与另一种方法结合起来:首先，研究人员成功地培育了肌肉纤维中已经存在Cas9蛋白的小鼠——仅在那里表达。然后，他们将所需的引导RNA与一种感染肌肉的腺相关病毒一起引入生物体。
这种组合导致肌肉纤维中的引导RNA与Cas9蛋白相遇，按预期改变遗传物质。第一作者Marco Thürkauf解释说:“这种方法使我们能够确保只有肌肉纤维真正改变了它们的遗传物质。”
更少的实验动物和更有效的结果
由于腺相关病毒也可以同时运输几个引导RNA，研究小组现在可以使用这种方法同时研究几个基因甚至整个信号通路。此外，该方法显著减少了所需实验动物的数量。“这使得研究肌肉纤维和神经肌肉疾病成为可能，而不需要使用大量的小鼠，”Marco Thürkauf说。其他研究小组也已经表达了他们的兴趣。“在我们的研究界，已经有几个感兴趣的团体想要使用我们的方法，”“这对肌肉研究本身以及我们减少动物实验的目标来说都是一个巨大的收获。”
实验摘要
随着组学技术的出现，可以将分子特征与细胞或组织的特定疾病状态联系起来，人们越来越需要研究基因和途径功能的方法。传统上，正向和反向遗传学使用靶向诱变与转基因相结合。聚集CRISPR介导的基因组编辑已成为许多物种和组织中基因工程的首选方法。
当涉及到骨骼肌组织时，在体内研究基因功能尤其具有挑战性。骨骼肌是最大的器官之一，占哺乳动物体重的50%。骨骼肌的功能收缩单位肌纤维的大小和事实，在一个共同的细胞质中形成一个由数百个肌核组成的合胞体，代表了体细胞基因失活的重大挑战。因此，通过Cre-loxP系统产生的肌肉残体转基因小鼠的功能基因询问研究的首选方法。然而，转基因小鼠的产生需要大量的育种，使得对多个基因的功能拷问变得繁琐和耗时。
有效的体细胞基因摄动方法将为筛选多种肌肉候选基因提供巨大的优势。RNA干扰可以通过引入短发夹(sh) RNAs3来沉默靶基因，可以急性沉默肌纤维中的基因表达，而长时间消除基因产物需要持续的高表达shRNA。病毒，特别是腺相关病毒(AAV)作为递送shRNA的载体的引入，开启了系统性给药的可能性。然而，由于缺乏对shRNA表达的组织特异性控制，基因沉默通常发生在所有转导细胞中。虽然下一代AAV衣壳具有设计的向骨骼肌组织趋向性可能改善离组织靶向性，但它们也都靶向心脏中的肌细胞。肌纤维的体细胞基因靶向的另一个挑战是组织的整体异质性。骨骼肌中几乎一半的细胞核来自非纤维细胞，如肌肉干细胞(MuSC)、内皮细胞、纤维脂肪生成前体(FAPs)、雪旺细胞或腱细胞，它们的功能紊乱通常也会影响肌纤维。因此，对于骨骼肌纤维的快速功能基因查询，迫切需要一种高效、可复用和肌肉纤维特异性的基因编辑方法。
作者建立了一个通用的工具，局部和系统性骨骼肌纤维特异性基因敲除。该工具将CRISPR的优势与最近开发的高效的AAV9衍生病毒衣壳结合起来，使用(i)在骨骼肌纤维中组成性或诱导性表达Cas9的小鼠，以及(ii)传递带有促肌性AAVMYO8的sgRNA。通过靶向关键基因，作者证明该系统能够有效地改变信号通路，破坏神经肌肉连接，刺激肌肉肥大，而无需产生感兴趣的种系基因缺失。AAV9-或AAV myo介导的sgRNA传递到表达Cas9的骨骼肌纤维可以实现快速、有效和特异性的基因敲除。多路性和诱导系统或局部基因编辑的能力进一步加强了系统的普遍性。因此，与传统敲除小鼠模型相比，该系统为骨骼肌纤维的功能丧失研究提供了宝贵的资源，并有望大大加快对新基因靶点的拷问，所需的动物数量大大减少，从而将有力地促进人们对骨骼肌生物学的理解。
