重组腺相关病毒（rAAV）是基因治疗中递送基因的重要载体，能转导多种细胞类型、非致病性、具有长期表达治疗性基因的潜力。在过去的几年里，基因治疗取得了巨大的成功，美国食品和药物管理局（FDA）批准了六种基于rAAV的药物，全球有350多种基于AAV的基因疗法正在进行临床试验。
AAV介导的基因传递的效率依赖于其进入宿主细胞并通过细胞内区室到达细胞核的能力。AAV通过附着于特定的细胞表面聚糖而进入细胞并进一步需要蛋白受体，这决定了不同衣壳的组织亲和性。多种聚糖已被鉴定为AAV载体使用的附着受体。一般来说，根据其聚糖受体的使用，AAV载体可分为三类：
1）AAV2、AAV3和AAV13用硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）；
2）AAV9用末端n链半乳糖。
3）AAV1、AAV4、AAV5和AAV6用α2,3-和α2,6-链唾液酸（SIA）。在使用SIA的AAV中，AAV5和AAV2.5T用α2,3 N-连接的SIA，AAV1和AAV6用α2,3和α2,6 N-连接的SIAs；AAV4是则是用α2,3 O-连接的SIA。跨膜蛋白KIAA0319L可作为多血清型AAV受体（AAVR），但不适用于AAV4及其相关血清型。
在多种AAV血清型中，AAV5表现出独特的特性，使其对肝脏、气道上皮、血管内皮细胞和平滑肌特别有效。基于rAAV5的基因疗法ROCTAVIAN和HEMGENIX目前分别用于血友病A和B的临床应用。通过衣壳基因的定向进化而产生的AAV5变体AAV2.5T显示出对人气道上皮的高度亲和性，在治疗囊性纤维化（CF）的体外CF气道上皮模型及临床前试验已表现出功能矫正的潜力。rAAV2.5T衣壳是AAV2的VP1独特结构域（aa1-119） （VP1u）与AAV5衣壳的剩余部分（aa120-725）的嵌合体，以及AAV5 VP1的一个关键点突变（A581T）。
经内吞作用内化后，AAV由各种核内体输送到反式-高尔基网（TGN），诱导AAV衣壳的构象变化和VP1u从衣壳表面脱出。VP1u含有磷脂酶A2 (PLA2）活动域能帮助AAV逃离这些囊泡进入细胞核。一旦进入细胞核，AAV就会进行脱壳以暴露其单链DNA基因组，然后将其转化为具有转录能力的双链DNA。已知能限制AAV进入和细胞内运输的宿主细胞因子，包括跨膜蛋白KIAA0319L (AAVR)，定位于TGN的G蛋白偶联受体108 (GPR108)，无名指蛋白121 （RNF121）和WD重复结构域63 (WDR63)等，但是奇怪的是GPR108对大多数rAAV载体的转导很重要，但对rAAV5并不重要，提示还有其他宿主因子参与了将AAV5加载到TGN的过程。
这项研究目的是要确定能影响AAV5转导的宿主因子，以揭开rAAV转导机制许多未解之谜中的一个。
研究要点
作者在rAAV5转导的悬浮293 F细胞中进行了全基因组CRISPR/Cas9筛选。经过两轮筛选成功识别了一些先前报道过的基因KIAA0319L，TM9SF2, RNF121，以及一组新的、参与聚糖生物发生高尔基体定位和内质网渗透的基因。他们重点研究了溶质载体族35成员A1 (solute carrier family 35 A1，SLC35A1)—— 一种高尔基体定位胞苷5′-单磷酸唾液酸（CMP-SIA）转运体，证实了其对rAAV转导至关重要——SLC35A1基因敲除（KO）显著降低rAAV5转导，低于KIAA0319L敲除细胞或TM9SF2敲除细胞。虽然 SLC35A1敲除显著降低了细胞表面α2,6-linked SIA的表达，但与rAAV5的细胞结合和内化相关的α2,3-linked SIA的表达仅受到中度影响。此外SLC35A1敲除还显著降低了不利用SIAs进行初级附着的rAAV2和rAAV3的转导；却显著增加了rAAV9和rAAV11的转导——rAAV9和rAAV11主要通过与半乳糖结合而附着在细胞上。
进一步的分析表明，敲除SLC35A1显著减少了载体进入细胞核。更值得注意的是，SLC35A1离开内质网并定位到高尔基体需要仅由20aa组成的C端细胞质尾部，而SLC35A1的C端胞质尾部缺失（∆C Tail）突变体没有显著降低SIA的表达，但它显著降低了rAAV的转导以及载体进入细胞核，这表明C尾在这些过程中起着关键作用。此外，T128A突变体显著降低了SIA的表达，但仍支持rAAV转导和核输入，证实了T128对SLC35A1的CMP-SIA转运体活性很重要。
这些结果强调了SLC35A1在rAAV初始细胞附着之后的细胞内运输中的关键作用，为优化基于rAAV的基因疗法提供了潜在的途径。
结论
敲除SLC35A1显著降低α2,6-连接的SIA的表达 (>90%)，仍保留部分α2,3-连接的SIA的表达（36%）
敲除SLC35A1显著降低了AAV1-8、12和13等多种AAV血清型的转导效率，而提高了AAV9和AAV11的转导效率。
敲除SLC35A1只减少了25%的AAV5内化，却导致了98%的rAAV5转导减少。敲除SLA35A1主要影响rAAV2.5T转导，而不会显著改变载体的结合和进入。
敲除SLC35A1可显著减少rAAV6的结合和进入，但对rAAV2的结合和进入细胞无显著影响；
敲除SLC35A减少rAAV2、rAAV5、rAAV6和rAAV9在HEK293细胞中的核输入，但提高AAV9转导效率
总之，SLC35A1的鉴定及其在AAV转导中的普遍作用对推进基于AAV的基因治疗具有重要意义。了解AAV5感染所需的特定宿主因子和其他血清型载体可以为设计更有效的载体提供信息，提高其在靶组织中的转导效率。此外，操纵糖基化途径，特别是涉及SLC35A1的糖基化途径，可以增强治疗基因的传递和表达。未来的研究应探索SLC35A1和其他已确定的因素，内质网渗透因素，促进AAV运输和核进入的详细机制。这可能导致优化AAV载体用于临床应用的发展。通过利用这项研究的见解，我们可以改进基因治疗的载体设计和递送策略，最终推进遗传疾病的治疗。
