来自瑞典哥德堡大学萨尔格伦斯卡学院精神病学和神经化学系等多个单位的研究人员在《Nature Medicine》杂志上发表了题为 “Phospho-tau serine-262 and serine-356 as biomarkers of pre-tangle soluble tau assemblies in Alzheimer’s disease” 的论文。该研究在阿尔茨海默病（AD）研究领域意义重大，为理解 AD 早期病理机制、开发新型诊断方法和治疗策略提供了关键线索。
AD 是一种常见的神经退行性疾病，其主要病理特征包括神经原纤维缠结（NFTs）和淀粉样 β（Aβ）斑块。NFTs 由 tau 蛋白聚合形成的纤维状细胞内聚集体构成，根据 Braak 分期评估的 tau 病理严重程度与认知结果的相关性和预测性比 Aβ 斑块更强。然而，目前的诊断方法对 NFTs 形成前的早期 tau 变化缺乏敏感性，且针对成熟 tau 纤维的治疗面临诸多挑战，同时缺乏量化生物流体中早期原纤维 tau 聚集体的生物标志物方法。
研究表明，生理缓冲液可溶的低阶 tau 聚集体（可溶性 tau 聚集体，STAs）在 tau 聚集级联反应的初始阶段形成，是高阶纤维和 NFTs 的构建块，在引发和传播 tau 毒性方面高效，有望成为早期诊断生物标志物和有效抗 tau 治疗的靶点。但目前对 STAs 的生化特征知之甚少，如组成 STAs 的 tau 结构域、关键序列、翻译后修饰以及在生物流体中的检测等问题亟待解决。
- 材料：研究使用了人类尸检大脑组织、脑脊液（CSF）样本、重组 tau 蛋白和小鼠等材料。人类大脑组织和 CSF 标本来自多个脑库和研究队列，包括伦敦大学学院皇后广场神经疾病脑库、荷兰脑库和加州大学圣地亚哥分校的 Shiley-Marcos 阿尔茨海默病研究中心（ADRC）等。小鼠选用 3 - 4 周龄的 C57BL/6 小鼠和 8 周龄的 Balb/c 小鼠。
- 方法
- FRET 测定：利用荧光共振能量转移（FRET）测定法定量人类尸检额叶灰质脑组织中的 STAs。通过将靶向 tau 蛋白特定序列的抗体分别与供体和受体分子偶联，当抗体与多价的 STAs 结合时会产生 FRET 信号，信号强度与 STAs 的数量和大小成正比。
- 免疫沉淀和质谱分析：使用多种抗 tau 抗体对大脑组织提取物进行免疫沉淀，结合质谱分析（MS）鉴定含有 STA 核心区域的 tau 形式，通过监测 tau 肽段的水平和富集效率，分析 tau 蛋白的分子特征。
- 免疫组化和免疫荧光：对尸检确诊的 AD 病例海马组织进行免疫组化和免疫荧光分析，检测不同磷酸化 tau 位点（如 p-tau₂₆₂、p-tau₃₅₆等）的表达和定位，评估其与 NFTs 病理阶段的关系。
- 电生理学实验：制备小鼠海马脑片，孵育不同的重组 tau 肽段，利用全细胞膜片钳记录技术检测神经元的兴奋性和突触传递变化，探究 STA 核心肽段对神经元功能的影响。
- CSF 检测方法开发：基于研究发现，利用单分子阵列（Simoa）技术开发检测人类 CSF 中 STAs 的方法，通过特定的捕获抗体和检测抗体，检测 CSF 中 STAs 的水平，并在多个队列中进行临床验证。
- STAs 生化检测方法的验证
- 通过 FRET 测定法，研究人员发现该方法对 AD 型 STAs 具有特异性。与 α - 突触核蛋白相比，tau₄₄₁产生的 FRET 信号更高，且重组 tau₄₄₁和 AD 脑额叶灰质组织中 STAs 的 FRET 信号随稀释倍数呈线性下降。在不同 tau 病（包括 AD、皮质基底节变性（CBD）、进行性核上性麻痹（PSP）和 Pick 病（PiD））及对照组的额叶灰质组织 TBS 可溶部分检测中，AD 组的 tau - FRET 信号最强，比对照组高约 300 倍，比其他原发性 tau 病高 15 - 43 倍，表明该测定法能有效区分 AD 型 STAs 与其他 tau 病中的 STAs。
- AD 脑 STAs 的核心区域
- 应用 tau - FRET 技术对 AD 脑 STAs 进行生化表征，通过免疫耗竭实验，研究人员发现 STA 核心主要位于 R2 - R4 区域，其核心序列约为 tau₂₅₈ - ₃₆₈。针对 tau 不同区域的抗体免疫耗竭实验表明，靶向该区域的抗体对 tau - FRET 信号的消耗作用最小。同时，发现 STA 核心区域在丝氨酸 - 262 和丝氨酸 - 356 处有显著磷酸化，免疫耗竭实验显示 p - tau₂₆₂和 p - tau₃₅₆抗体的可及性有限，说明这些表位是核心的组成部分。
- 利用免疫印迹毛细管电泳和 MS 分析，研究人员进一步验证了 STA 核心和构成模糊外层的 tau 分子形式。结果表明，含有 STA 核心的 tau 形式包括近全长序列，可从 N 端延伸到 MTBR，从中部区域延伸到 C 端远端。
- p - tau₂₆₂和 p - tau₃₅₆在早期 NFTs 检测中的作用
- 对不同 tau 病理阶段（低 Braak NFT 阶段 0 - II 和高 Braak NFT 阶段 V 和 VI）的尸检病例海马 CA1 区进行免疫组化分析，发现 p - tau₂₆₂和 p - tau₃₅₆的免疫染色模式与其他常用 p - tau 抗体（如 AT8（p - tau₂₀₂/₂₀₅））不同。p - tau₂₆₂和 p - tau₃₅₆主要标记海马神经元内的颗粒状结构，而 p - tau₂₃₁和 p - tau₂₀₂/₂₀₅抗体在神经元和神经毡丝中的免疫标记更为弥散。在低 Braak NFT 阶段，许多 p - tau₂₀₂/₂₀₅标记的神经元中，p - tau₂₆₂或 p - tau₃₅₆标记局限于部分细胞质；在高 Braak NFT 阶段，p - tau₂₆₂和 p - tau₃₅₆仅在部分 p - tau₂₀₂/₂₀₅标记的神经元中出现，且几乎不存在于 p - tau₂₀₂/₂₀₅标记的神经毡丝中。三重荧光标记实验表明，X - 34 标记的 NFTs 常含有 p - tau₂₀₂/₂₀₅信号，但 p - tau₂₆₂和 p - tau₃₅₆免疫信号不明显，说明 p - tau₂₆₂和 p - tau₃₅₆可检测早期 NFTs。
- 通过三明治酶联免疫吸附试验（ELISAs）和 MS 分析，验证了 p - tau₂₆₂和 p - tau₃₅₆抗体的特异性。结果显示，这些抗体对经 Ca²⁺和钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II（CAMK2）、BR 丝氨酸 / 苏氨酸激酶 2（BRSK2）和蛋白激酶 A 磷酸化的 tau₄₄₁蛋白具有高反应性，且合成肽竞争实验进一步证实了抗体的特异性。
- STA 核心肽段的体外聚集和功能影响
- 表达和纯化重组 STA 核心肽段（aa 258 - 368），通过表面等离子共振（SPR）实验和电子显微镜分析，发现 STA 核心肽段比之前通过冷冻电镜鉴定的纤维核心肽段（aa 302 - 368）聚集更快，且能形成聚集体，而 N 端和 C 端对照序列则无明显聚集。
- 电生理学实验表明，在小鼠海马脑片实验中，STA 核心肽段能使神经元静息膜电位（RMP）显著去极化，增加输入电阻（IR），提高动作电位发放频率（FR），且能显著增加配对脉冲易化程度，说明 STA 核心肽段能损害神经元兴奋性，调节神经元和网络功能。
- 人类 CSF 中 STAs 的检测及临床意义
- 利用 Simoa 技术开发了检测人类 CSF 中 STAs 的方法，该方法使用 tau₃₆₈（针对 aa 368 处病理截断的新特异性抗体）作为捕获抗体，CT23.1（aa 321 - 371）作为检测抗体。在队列 3（n = 67）中进行临床验证，发现 CSF 中 STA 与总 tau（t - tau）的比值在不同临床诊断和病理诊断组间存在显著差异，与 Braak NFT 分期显著相关，且不受年龄、性别和 CSF 采集与死亡时间间隔的影响，也与 Aβ 沉积无关，表明该比值可反映中枢神经系统来源的 CSF STA 水平。
- 在队列 4（n = 185）中，CSF 中 STA 和 t - tau 的比值在不同 tau - PET 诊断组间存在差异，与认知功能相关，且与 tau - PET 检测的脑内 NFT 负担呈负相关，说明该比值可作为评估 AD 病理进展和认知功能的生物标志物。
研究人员通过整合生化方法，鉴定出 AD 脑中 STAs 的核心肽段（~aa 258 - 368），揭示了 p - tau₂₆₂和 p - tau₃₅₆这两个与聚集相关的磷酸化位点，开发了一种检测 CSF 中 tau 前 NFT 病理的生物标志物，并在多个队列中验证了其临床性能。
该研究成果具有多方面重要意义。在诊断方面，目前血浆和 CSF 中的 p - tau 生物标志物与脑 tau 病理的关联较弱，而新发现的 STA 核心提供了一种可检测非纤维状 tau 物种的 CSF 生物标志物，有助于更准确地诊断 AD。在病理机制研究方面，明确了 STAs 的生化特征和相关磷酸化位点，有助于深入理解 tau 聚集的早期过程，为开发针对早期 tau 聚集的治疗方法提供了理论基础。此外，对 p - tau₂₆₂和 p - tau₃₅₆的研究表明，它们是 tau 病理的早期指标，可能在 tau 聚集的起始阶段发挥关键作用，为 AD 的早期干预提供了潜在靶点。未来，基于这些发现开发的生物流体生物标志物检测方法，有望识别出具有原纤维前 tau 病理的个体，推动 AD 机制研究和治疗试验的发展，为 AD 的防治带来新的希望 。
