多重耐药菌对人类健康构成重大威胁，由于新药研发速度远不及抗生素耐药性的传播速度，迫切需要新的治疗策略。通过删除细菌毒力基因或抗生素耐药基因来对抗超级细菌是一种潜在策略，然而当前细菌基因编辑技术存在诸多限制，如仅适用于模式微生物，且 CRISPR - Cas 系统的运输困难。
在真核生物中，小 RNA（sRNA）可通过 RNA 干扰（RNAi）调节基因表达，已有多种 sRNA 药物应用于临床。但由于细菌缺乏 RNAi 调控机制（如 RNA 诱导沉默复合体，RISCs）以及缺乏有效的 sRNA 递送方法，sRNA 尚未用于调节细菌基因。细胞外囊泡（EVs）可实现生物分子的细胞间交换，外泌体作为 EVs 的一种，在哺乳动物中可运输微小 RNA（miRNA）等生物分子，且含有 RNAi 关键蛋白 AGO2，因此外泌体有望成为将 sRNA 和 RNA 调控机制运输到细菌的载体。
为研究外泌体与细菌的相互作用，研究人员选用大肠杆菌作为模型。通过转染 HEK293T 细胞使其分泌含有小干扰 RNA（siRNA）的外泌体，即 siAda - Exos。实验表明，与 siAda - Exos 共培养的大肠杆菌细胞可摄取 siAda，且摄取量与外泌体剂量相关，对数生长期摄取效率最高。而游离的 siAda 或与脂质体孵育的 siAda 均无法被大肠杆菌摄取，说明外泌体的包裹对 siRNA 进入大肠杆菌至关重要。此外，不同人类细胞系分泌的外泌体均可将 sRNA 运输到大肠杆菌中，证明了 sRNA 递送的普遍性。
研究人员制备了含有 Cy3 标记 siAda 的外泌体，并与大肠杆菌共培养。通过共聚焦显微镜和免疫金透射电子显微镜（TEM）分析发现，siAda 进入了大肠杆菌细胞质，而外泌体的膜成分与大肠杆菌细胞膜融合。同时，在大肠杆菌样本中鉴定出 26 种人类外泌体 miRNA，表明 siRNA 和 miRNA 均可被运输到大肠杆菌细胞内。TEM 分析还显示，外泌体可能通过大肠杆菌细胞膜的破损区域进入细胞，这与大肠杆菌和铜绿假单胞菌外膜囊泡的融合现象类似。
与阴性对照 RNA（ncRNA） - Exos 处理的样本相比，成功递送 siAda 的大肠杆菌中，Ada 表达呈剂量依赖性下调，但 ada 基因的 mRNA 水平并未下降，说明基因沉默主要是由翻译抑制而非 mRNA 降解引起。将游离 siAda 电穿孔导入大肠杆菌，未影响 ada mRNA 和 Ada 蛋白的表达水平，表明 Ada 蛋白表达下调并非由 siAda 介导的内源性细菌 RNA 调控途径导致。免疫沉淀（IP）分析表明，siAda - Exos 中的 siAda 主要与 AGO2 蛋白结合，且这些 AGO2 - siAda 复合物在大肠杆菌细胞裂解物中可被检测到。通过制备 AGO2 敲低的 HEK293T 细胞来源的 siAda - ExosAGO2 - KD，发现 AGO2 敲低可逆转 siAda 对 Ada 蛋白表达的下调作用，证明 AGO2 负责 siAda 介导的基因沉默。此外，研究还发现外泌体介导的 RNAi 在序列不完全匹配时仍能发挥作用，3′端突变 4 个核苷酸的 siRNA 仍可抑制靶基因翻译，但 5′端或中间突变则会失去该功能，4 - nt 错配可能是序列匹配的极限。
革兰氏阳性病原体甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）是人类致命感染的常见原因，其携带的 mecA 基因编码青霉素结合蛋白 2a（PBP2a），导致对甲氧西林耐药。研究人员制备了含有 siMecA 的外泌体（siMecA - Exos），并与 MRSA 共培养，结果显示 siMecA 成功递送至 MRSA 细胞内，且 PBP2a 蛋白表达显著下降，mecA 基因的 mRNA 水平未降低，表明基因沉默主要由翻译抑制引起。
siMecA - Exos 处理后，MRSA 对甲氧西林的最低抑菌浓度（MIC）降低，与甲氧西林联合使用时杀菌活性增强。IP 分析表明，siMecA - Exos 中的 siMecA 主要与 AGO2 蛋白结合，且 AGO2 与 mecA mRNA 相关，说明 AGO2 - siMecA - (mRNAmecA) 复合物可能形成并降低 PBP2a 蛋白表达。制备 AGO2 敲低的 siMecA - ExosAGO2 - KD，发现其可逆转 siMecA - Exo 对 MRSA 的作用，证明外泌体 AGO2 对 siMecA 介导的基因沉默至关重要。此外，GW182 蛋白也参与了 siMecA 介导的基因沉默过程，siMecA 序列突变实验表明，3 - nt 突变的 siMecA 仍有杀菌活性，但弱于未突变的 siMecA，3′端突变的效果优于 5′端或中间突变。研究人员还通过 RNA pull - down 实验鉴定出几种可能与 siMecA 相互作用的葡萄球菌蛋白，其中延伸因子 Tu 与翻译关系最为密切，但具体机制仍需进一步研究。
基于上述研究，研究人员推测 siMecA - Exos 可降低 MRSA 在体内的耐药性，增强甲氧西林的治疗效果。在 BALB/c 小鼠感染 MRSA 模型中，同时给予甲氧西林和 siMecA - Exos，可有效保护小鼠免受致命感染，提高小鼠存活率，减少感染小鼠器官和血清中的葡萄球菌载量，降低炎症生物标志物水平。从感染小鼠血液中分离的 MRSA 细胞中检测到 siMecA 和 AGO2 蛋白，且 PBP2a 蛋白表达下调，表明外泌体介导的 siMecA 递送和 mecA 基因沉默在小鼠体内确实发生，并有助于增强甲氧西林的治疗效果。
体外制备的外泌体用于治疗存在纯度、免疫原性和致癌性等问题。研究人员开发了一种利用宿主肝脏合成和分泌含有特定 siRNA 序列外泌体的策略，构建了 siMecA 电路。实验表明，该电路可在体外成功表达和装载 siMecA，且在体内可产生 siMecA - Exosmice并进入血液循环。给予感染 MRSA 的小鼠甲氧西林和 siMecA 电路，可有效保护小鼠免受感染，降低细菌载量，证明体内自组装的 siMecA - Exosmice可有效沉默 MRSA 耐药基因，促进抗生素治疗。通过注射表达 Lamp2b - GFP 融合蛋白的电路，观察到 MRSA 细胞摄取 GFP - Exo，进一步证实了细菌在体内可摄取外泌体。
本研究揭示了哺乳动物细胞来源的外泌体可有效将 sRNA 运输到细菌中，诱导细菌基因沉默。然而，RNAi 在细菌中的作用机制与真核细胞不同，虽然 siRNA 与靶基因完全碱基配对，但细菌基因沉默主要是翻译抑制而非 mRNA 切割。研究人员推测可能存在未知机制抑制 AGO2 的切割活性，且 AGO2 - siRNA 复合物可能与其他蛋白相互作用，阻碍核糖体结合或导致核糖体停滞，从而抑制翻译。此外，外泌体介导的 RNAi 在序列不完全匹配时也能发挥作用，这为研究外泌体 miRNA 调节细菌基因提供了思路。
本研究展示了利用外泌体介导 RNAi 治疗细菌感染的潜力，与传统抗生素相比，该策略可通过匹配合成 sRNA 序列克服细菌耐药突变。结合利用宿主肝脏产生循环外泌体的合成生物学技术，外泌体介导的细菌基因调控有望成为治疗病原体感染相关疾病的有效策略。研究人员还计算了小鼠模型中的剂量效应关系，为未来人体应用提供参考。
siRNA - AGO2 复合物抑制细菌蛋白质翻译的机制仍需进一步研究，目前将 siRNA - AGO2 复合物电穿孔导入细菌以确认机制的技术存在限制。外泌体纯化方法中，用 RNase 和 DNase 处理分离的外泌体以去除非特异性结合的核酸，可提高结果的特异性。此外，还需使用更广泛的临床菌株和模型来验证研究结果，由于目前甲氧西林在临床应用较少，未来研究将聚焦于使用临床可用抗生素，以确保研究的实用性。
如需进一步信息、资源和试剂，可联系通讯作者 Huan Wang（wanghuan@nju.edu.cn）。本研究未产生新的独特试剂。测序数据集已存入 GEO 数据库（GEO：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE122212），论文未报告原始代码，如需重新分析数据，可向通讯作者索取相关信息。
感谢 Yin Ding 博士、Hao Zhang 博士和 Qipeng Zhang 博士在实验技术和数据分析方面的帮助。本研究得到了多项基金的支持，包括国家重点研发计划、国家自然科学基金、江苏省自然科学基金、中央高校基本科研业务费等。
C.-Y.Z.、H.W.、H.B. 和 C.W. 设计并监督了本研究。C.W.、W.S. 等多人进行了实验。C.W.、H.W. 等多人分析了数据。H.B.、H.L. 等多人提供了实验材料。Z.Z.、X.L. 和 H.S. 进行了生物信息学分析。C.W.、H.W. 和 C.-Y.Z. 撰写了论文。
C.-Y.Z.、C.W. 和 H.W. 是与本研究相关的专利申请（PCT/CN2020/133392）的共同发明人。
实验使用了多种人类细胞系、大肠杆菌和 MRSA 菌株，以及 BALB/c 小鼠。细胞系购自中国细胞培养中心，细菌菌株购自 Invitrogen 或由其他实验室馈赠，小鼠来自南京医科大学，在特定病原体 - free 条件下饲养，实验遵循动物伦理和福利委员会的指导方针。
实验涉及多种技术方法，包括细胞转染、外泌体纯化、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、细菌与外泌体共孵育、定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）、电穿孔、Illumina HiSeq 数据分析、共聚焦显微镜分析、免疫 TEM 分析、蛋白质免疫印迹分析（Western blot analysis）、免疫沉淀测定、RNA pull - down 测定、Northern blot 分析、最低抑菌浓度（MIC）测定、时间杀菌测定、小鼠感染模型、MRSA 细菌分离、siMecA 电路构建和 sRNA 含量计算等，每种方法都有详细的操作步骤和参数设置。
实验数据使用 GraphPad Prism v9 进行统计分析，数据以平均值 ± 标准误（SEM）或平均值 ± 标准差（SD）表示，根据实验设计选择合适的统计检验方法，如 Student’s t 检验、单因素方差分析（One - way ANOVA）、双因素方差分析（Two - way ANOVA）、对数秩检验（log rank test）和非参数 Mann - Whitney 检验等，p < 0.05 被认为具有统计学意义。
文章提供了补充信息，包括 Figures S1 - S14、Tables S1 - S4 等，可在相关链接中下载查看，这些补充信息包含了实验的详细数据和结果，有助于更全面地理解研究内容。
