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2023年11月7日，王钊教授课题组以“SIRT6 deficiency causes ovarian hypoplasia by affecting Plod1-related collagen formation”为题在衰老领域专业期刊Aging Cell杂志在线发表研究论文。此文报道了SIRT6缺失会导致小鼠卵巢发育异常，包括初情期、动情周期的中断，次级卵泡和窦泡卵泡数量显著减少，卵巢基质中的胶原蛋白显著降低等。这一作用主要是通过影响胶原合成相关赖氨酸羟化酶PLOD1的表达以及雌激素的合成实现的。

研究背景

SIRT6是保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖脱乙酰酶的哺乳动物sirtuin家族的关键成员。研究表明，SIRT6可以调节新陈代谢、DNA损伤修复和衰老。有报道称，SIRT6在老龄小鼠卵巢中表达水平显著降低，且SIRT6水平与卵巢储备能力呈正相关，提示SIRT6可能是卵巢衰老的潜在标志物。既往研究表明，热量限制（calorie restriction，CR）可延长雌性大鼠的繁殖寿命，维持卵泡储备，延缓成年大鼠卵巢功能衰竭，其作用被发现与mTOR信号的衰减和卵巢SIRT1和SIRT6等底物FOXO3a和NRFI11水平的升高有关。在大鼠中，烷基化剂引起的卵巢损伤导致SIRT1、SIRT3和SIRT6表达下降，可通过白藜芦醇或热量限制等激活sirtuin表达的方法加以抵消。此外，SIRT6在调控卵母细胞减数分裂过程也发挥了重要作用，SIRT6的缺失会导致卵母细胞纺锤体形态和染色体排列的破坏。然而，SIRT6在卵泡维持中发挥作用的分子机制尚未被完全阐明，其对卵巢颗粒细胞及卵巢间质的影响尚不清楚。

研究成果

1）SIRT6缺失导致小鼠初情期、动情周期中断。

SIRT6 敲除小鼠与野生型小鼠相比，表现出明显的体型缩小和体重下降。通过观察和记录小鼠阴道开口时间（初情期）和动情周期发现，SIRT6敲除小鼠阴道口直至其死亡仍未打开（平均死亡年龄29.25 天），而其同窝野生型小鼠初情期到来的平均时间为24.67 天。此外，SIRT6敲除小鼠由于阴道口一直关闭，未观察到正常的动情周期，表明SIRT6缺失会导致雌性小鼠生殖系统发育异常。

图1. SIRT6敲除小鼠初情期推迟且无正常动情周期

2）SIRT6缺失导致小鼠卵泡发育异常

初情期、动情周期的开始和维持与卵泡发育及雌激素水平密切相关。此项研究结果表明，SIRT6 敲除小鼠卵巢相较野生型小鼠卵巢的体积及卵巢间质厚度显著减小。同时，SIRT6敲除小鼠卵巢中原始卵泡数量明显减少，卵巢储备能力减弱；大多数卵泡处于未成熟阶段，且未发现次级卵泡和窦状卵泡，SIRT6缺失导致卵泡发育被阻断在初级卵泡阶段。这一现象与上述观察到的SIRT6敲除小鼠初情期及动情周期中断这一现象一致。

图2. SIRT6敲除小鼠卵巢发育异常、次级及窦状卵泡显著减少

3）SIRT6 缺失导致卵巢中雌激素生物合成相关基因表达量下调

对RNA-seq结果进行加权基因共表达分析后发现，SIRT6缺失导致小鼠卵巢中一系列与类固醇激素生物合成相关的基因表达量发生改变。随后，对参与胆固醇或类固醇生物合成的几个基因进行RT-qPCR验证发现，其表达量都显著下调。在所有检测到的基因中，Cyp11a1和Cyp19a1与雌激素生物合成密切相关。Cyp19a1通常被用作颗粒细胞的标记基因，与小卵泡（3-5mm）相比，其在大卵泡（>9mm）中表达量上调。CYP11A1的稳定表达对维持卵泡的正常状态和功能至关重要，与健康卵泡相比，生长受损卵泡中CYP11A1的表达水平明显降低。SIRT6 敲除小鼠的卵泡大多阻断于初级卵泡阶段，没有次级或窦状卵泡，其卵巢组织中Cyp19a1与Cyp11a1的表达也显著下调，这些结果提示SIRT6 敲除小鼠卵巢发育不全的出现可能与Cyp11a1和Cyp19a1的低表达有关。同时，在SIRT6低表达的卵巢颗粒细胞模型中，Cyp11a1和Cyp19a1基因表达量也显著减少，颗粒细胞上清液中雌二醇的含量较对照组也显著降低。

图3. SIRT6敲除小鼠卵巢中雌激素生物合成相关基因表达量改变显著

4）SIRT6缺失导致Plod1基因表达和胶原蛋白表达降低

蛋白质组学分析发现SIRT6 敲除小鼠中有一系列被沉默的蛋白，其中MGARP的表达量变化最大。MGARP是一种主要表达于类固醇组织中的新型线粒体跨膜蛋白。已有研究表明，MGARP参与激素的生物合成，其表达受HPG 轴的调控，并被认为是颗粒细胞新的潜在标志物。与小卵泡(3-5mm)相比，MGARP在大卵泡(>9mm)中的表达上调，表达谱变化与Cyp19a1在卵泡发育过程中的表达谱相似。

PLOD1是一种赖氨酸羟化酶，对胶原交联和沉积以及LLH1蛋白的生物合成至关重要。赖氨酸羟化酶是一种定位于内质网池的膜结合二聚体蛋白，可催化胶原样肽中赖氨酸残基的羟基化。结果显示，SIRT6 敲除小鼠卵巢中Plod1及其相关蛋白LLH1的表达水平显著降低。同时，SIRT6敲除小鼠卵巢胶原蛋白厚度明显降低。SIRT6 低表达的卵巢颗粒细胞中Plod1的表达也下调。

图4. SIRT6敲除小鼠卵巢间质中胶原蛋白显著下降，胶原合成相关基因表达量下调

5）SIRT6直接与Plod1、Mgarp和Cyp11a1基因启动子结合，调控其转录

以SIRT6 低表达的卵巢颗粒细胞为基础，构建Cyp11a1和Cyp19a1过表达细胞模型。发现Cyp11a1的过表达可以补偿SIRT6敲低导致的Cyp19a1下调，而Cyp19a1的过表达亦可补偿SIRT6敲低导致的Cyp11a1下调。SIRT6敲低导致的雌二醇水平下降也通过Cyp11a1和Cyp19a1过表达得到部分恢复。

基于Cistrome Data Browser中ChIP-seq的结果预测，SIRT6在小鼠胚胎组织中与Plod1、Mgarp和Cyp11a1启动子结合。在小鼠卵泡颗粒细胞模型中的染色质免疫沉淀（ChIP）实验显示，SIRT6 过表达细胞系与野生型小鼠卵泡颗粒细胞相比，在Plod1, Mgarp和Cyp11a1启动子上SIRT6的结合增加，而在SIRT6低表达卵泡颗粒细胞中几乎没有检测到与SIRT6的结合。表明SIRT6通过直接结合Plod1、Mgarp和Cyp11a1的启动子区域来调节它们的表达。

图5. SIRT6低表达的卵巢颗粒细胞中Cyp11a1或Cyp19a1基因的恢复可挽救因SIRT6缺失导致的雌激素水平下降

研究结论

胶原蛋白是一大类糖蛋白，是组织的结构基石，是细胞外基质（ECM）的主要成分，对卵泡的发育非常重要，有助于卵泡液的形成，过滤可溶性物质，并为组织提供刚性或弹性的机械支持。既往研究表明，基质缺乏会抑制颗粒膜的去极化转化，导致卵泡发育迟缓。例如甲状腺功能减退导致雌性大鼠生殖功能障碍，其主要作用机制是下调胶原生物合成途径第一步关键酶（Plod1、Plod2和Plod3）的表达，进而干扰卵巢胶原生物合成。在卵泡发育过程中，随着卵泡壁的扩大，卵泡壁会发生不断的重塑，Plod基因的下调会抑制新胶原的形成，导致胶原状态和卵巢结构的整体紊乱，导致卵泡发育异常，同时也影响类固醇的合成。该项研究显示，SIRT6 缺失小鼠的大部分卵泡停滞在初级卵泡阶段，卵巢间质中胶原蛋白表达显著降低。在SIRT6缺失的颗粒细胞和卵巢中，胶原蛋白合成相关基因Plod1的mRNA及蛋白水平均显著下调。ChIP实验证明SIRT6直接与Plod1基因结合并调节其表达，这表明SIRT6缺失通过下调Plod1表达和胶原形成导致卵泡发育不全。

图6. SIRT6调节卵泡发育的分子机制示意图

该项研究证实了SIRT6对卵泡发育的影响，并揭示了SIRT6通过影响胶原形成参与卵泡发育，提示SIRT6是卵巢发育和胶原形成的重要靶标。该研究有助于我们更深入地了解卵巢的发育过程，为卵巢早衰及其他功能障碍相关疾病的机制提供理论依据，有助于发现更为有效的改善卵巢健康状况的新干预措施。

清华大学药学院王钊教授为本文通讯作者，课题组已出站博士后李丽媛、在读博士生花瑞为文章共同第一作者。课题组成员胡凯强、陈辉玲、尹月淼等，以及清华大学药学院刘清飞副教授、清华大学医学院裘莹副教授、清华大学医学院李雪高级工程师、复旦大学刘上峰教授为本课题提供了重要帮助。本研究得到国家自然科学基金（81974503, 81871095）、国际科技合作重点项目（2016YFE113700）等基金的大力支持。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/acel.14031