为了攻克这个难题，陆军军医大学西南医院肝胆胰外科研究所、重庆医科大学附属第二医院等机构的研究人员展开了深入研究。他们聚焦于巨噬细胞中的 T 细胞免疫球蛋白黏蛋白 - 3（TIM3），想弄清楚它在 NAFLD 相关慢性肝损伤中到底扮演着什么角色，同时也希望找到适合进行抗 TIM3 免疫治疗的纤维化患者亚型。
研究人员通过一系列实验，得出了不少重要结论。在小鼠模型中，他们发现长期喂食甲硫氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食或高脂饮食（HFD）的小鼠，肝脏巨噬细胞中 TIM3 的表达显著升高。进一步研究发现，β - 转导重复蛋白（β-TrCP）能够促进 TIM3 的多聚泛素化和膜转位，而泛素化的 TIM3 会与磷脂酰肌醇 - 3 - 激酶（PI3K）结合，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路，从而促进巨噬细胞向 M2 极化并释放转化生长因子 β（TGF-β），最终导致肝星状细胞（HSC）激活和肝纤维化。
在探究 TIM3 表达增加的机制时，研究人员发现这与转录因子 TATA 结合蛋白（TBP）的上调以及 miR-4524a-5p 的下调有关。在临床研究中，他们对 48 例非酒精性脂肪性肝病患者的肝脏组织进行分析，发现患者肝脏中 TIM3 的表达与 TBP 呈正相关，与 miR-4524a-5p 呈负相关，而且血浆中 miR-4524a-5p 的减少可以作为适合抗 TIM3 治疗的 NASH 纤维化患者的生物标志物。
这项研究成果发表在《Cell Death and Disease》上，为理解 NAFLD 相关肝纤维化的发病机制提供了新的视角，也为开发针对慢性 NASH 纤维化患者的免疫治疗策略提供了潜在的靶点和生物标志物，对推动 NAFLD 的治疗发展具有重要意义。
研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。在样本获取方面，收集了 48 例经活检证实的非酒精性脂肪性肝病患者的组织样本，并使用野生型（WT）C57BL/6J 小鼠、Havcr2fl/+ ; Lyz2-cre 和 TIM3 敲低（Havcr2+/− ）小鼠构建了 NAFLD 和 NASH 纤维化模型。在检测分析技术上，采用了定量聚合酶链反应（qPCR）检测基因表达水平，蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达，免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）染色观察蛋白定位和表达，染色质免疫沉淀（ChIP）实验验证转录因子与基因的结合，双荧光素酶报告基因实验验证 miRNA 与靶基因的结合。
- 巨噬细胞中升高的 TIM3 与小鼠慢性 NASH 纤维化发展正相关：研究人员通过建立 NASH 纤维化小鼠模型，发现 MCD 或 HFD 喂养后，小鼠出现肝纤维化，同时 Havcr2（编码 TIM3）在纤维化肝脏组织中显著上调，且 TIM3 在巨噬细胞中高表达。在不同阶段的 NAFLD 小鼠模型中，敲低 Havcr2 后发现，早期（2 周 MCD 喂养）炎症细胞因子增加但纤维化无明显差异，后期（5 周 MCD 喂养）肝纤维化显著减轻，这表明巨噬细胞中升高的 TIM3 与慢性 NASH 纤维化发展相关。
- β -TrCP 促进泛素化的 TIM3 膜定位并与 PI3K 结合诱导 M2 极化：研究发现 β -TrCP 在 MCD 喂养小鼠和 PA 处理的 RAW264.7 细胞中表达增加，它能促进 TIM3 的 K63 连接的泛素化和膜转位，并促进 TIM3 与 PI3K 的 p85 亚基结合。敲低 Havcr2 可上调 mTOR 及其下游分子的磷酸化水平，促进 M1 极化，而抑制 mTOR 可阻断这一作用，表明 β -TrCP 通过促进 TIM3 膜定位，经 TIM3 - PI3K 相互作用诱导 M2 极化。
- 巨噬细胞中升高的 TIM3 归因于 TBP 表达：通过生物信息学预测和实验验证，发现 TBP 是调控巨噬细胞 TIM3 表达的关键转录因子。TBP 在 MCD 处理的原代 KCs 和肝脏组织中表达增加，且能结合到 Havcr2 启动子区域。敲低 TBP 可降低 TIM3 表达，激活 AKT/mTOR 信号通路并促进 M1 极化；过表达 TBP 则相反，这说明巨噬细胞中升高的 TIM3 依赖于 TBP。
- miR-4524a-5p 下调增加巨噬细胞中 TBP 和 TIM3 的表达：预测可能靶向 TBP 的 miRNA 并进行分析，发现 miR-4524a-5p 在 NASH 纤维化中表达降低。过表达 miR-4524a-5p 可降低 TBP 和 TIM3 表达，诱导 M1 极化，而过表达 TBP 可减弱这一作用，表明 miR-4524a-5p 下调会增加 TBP 和 TIM3 表达，诱导 M2 极化。
- miR-4524a-5p/TBP/TIM3/mTOR 信号通路通过增加巨噬细胞中 TGF-β 的表达促进 HSC 激活：将巨噬细胞条件培养基（CM）作用于肝星状细胞系 JS1，发现高表达 TIM3 的巨噬细胞 CM 促进 HSC 增殖和激活，而敲低 Havcr2、增加 miR-4524a-5p 或敲低 TBP 则抑制这一过程。此外，敲低 Havcr2 可降低巨噬细胞中 TGF-β 的表达，阻断 TGF-β 可抑制 HSC 激活，表明该信号通路通过诱导 TGF-β 分泌促进 HSC 增殖和激活。
- 阻断 TIM3 诱导 M1 巨噬细胞极化并预防小鼠慢性 NASH 纤维化：给 MCD 喂养的小鼠腹腔注射抗 TIM3 抗体，发现小鼠肝功能恢复，肝纤维化减轻，同时 M1 巨噬细胞极化增加，TGF-β 分泌减少，表明靶向 TIM3 可促进 M1 极化，减少 TGF-β 分泌，抑制 HSC 激活和纤维化。
- 晚期肝纤维化患者中 TIM3 表达升高与 TBP 正相关：对 48 例 NASH 患者肝脏组织分析发现，血浆 ALT 和 AST 水平与 Havcr2 表达正相关，且晚期纤维化（F3 - 4 期）患者的 TIM3 表达高于早期（F0 - 2 期）患者。此外，NASH 患者血液中 miR-4524a-5p 表达低于健康人，且与 Havcr2 表达呈负相关，可作为适合抗 TIM3 治疗的生物标志物。
研究表明，巨噬细胞中 β-TrCP 介导的 TIM3 泛素化和激活，通过促进 M2 极化、产生促纤维化因子 TGF-β 并支持 HSC 激活，从而推动 NAFLD 慢性纤维化进程。因此，靶向 TIM3 在慢性 NASH 纤维化患者的免疫治疗中可能发挥重要作用。不过，该研究也存在一些局限性，如 MCD 模型不能完全模拟临床病理表现，未检测 TIM3 的配体，体外实验结果未在体内验证等。但总体而言，这项研究为 NAFLD 相关肝纤维化的治疗开辟了新方向，有望为未来的临床治疗提供有力的理论依据和潜在靶点。
