A20：急性肾损伤中氧化自身 DNA 炎症的 “刹车器”，开启肾病治疗新方向

在人体的精密运转中，肾脏就像一台高效的 “过滤器”，持续清理血液中的废物和多余水分，维持身体的内环境稳定。然而，急性肾损伤（AKI）却如同一场突如其来的 “风暴”，打破了这份平静。AKI 是一种严重威胁生命的疾病，它会使肾功能在短时间内急剧下降，导致患者死亡率和发病率居高不下。据统计，约 13% 接受顺铂首次治疗的患者会发生 AKI。尽管引发 AKI 的初始因素多种多样，但细胞死亡、组织损伤和剧烈炎症等共同的致病因素在其病理过程中起着关键作用。

在 AKI 的众多发病机制中，危险相关分子模式（DAMPs）的释放备受关注。作为 DAMPs 的一种，自身 DNA 源于死亡细胞，在癌症、创伤和病毒感染等病理状态下大量出现。其中，氧化的双链 DNA（ox-dsDNA）尤为特殊，它不仅能激活 cGAS-STING 通路和 NLRP3 炎性小体，引发免疫反应和无菌性炎症，还对核酸外切酶具有抗性，难以被细胞外降解，从而持续加剧炎症反应和组织损伤。而 NLRP3 炎性小体作为细胞内的 “危险探测器”，在感知到 ox-dsDNA 等刺激后，会迅速组装并激活，诱导细胞焦亡，释放大量炎性细胞因子，进一步放大炎症反应。

在炎症反应的调控中，A20 作为一种泛素编辑酶，虽然已知其在调节炎症和维持体内平衡方面发挥着重要作用，但它在 AKI 中对自身 DNA 介导的炎症的具体作用机制却一直扑朔迷离。正是在这样的背景下，四川大学生命科学领域的研究人员为了揭开这些谜团，开展了一项深入的研究，相关成果发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》杂志上。

研究人员运用了多种关键技术方法来开展此项研究。在动物实验方面，通过构建多种 AKI 小鼠模型，如顺铂、马兜铃酸 I（AA I）或脂多糖（LPS）诱导的模型，模拟人类 AKI 的发病过程。同时，利用基因编辑技术，制备了基因敲除小鼠，包括 A20^myel-KO小鼠和 Nek7^myel-KO小鼠，以探究相关基因在 AKI 中的功能。在细胞实验中，对多种细胞进行培养和处理，运用 RNA 测序（RNA-Seq）技术分析基因表达谱的变化，采用免疫印迹（immunoblotting）、共免疫沉淀（co-IP）等方法检测蛋白表达和相互作用。此外，还使用了酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子水平，通过生物膜干涉技术（BLI）分析蛋白与肽段的结合亲和力。研究中使用的样本队列包括人类血清样本（来自败血症患者和正常 donors）以及小鼠的血清、肾脏组织和细胞等。

下面让我们详细了解一下该研究的主要结果：

氧化自身 DNA 促进 AKI 进展：研究人员发现，败血症患者血清 DNA 水平升高，同时 AKI 小鼠模型血清 DNA 水平及肾脏组织中 8 - 羟基 - 2'- 脱氧鸟苷（8OH-dG）水平也显著上升，这表明 AKI 过程中有氧化自身 DNA 的释放。免疫荧光染色显示，巨噬细胞会吞噬肾脏组织中的 ox - 自身 DNA，提示巨噬细胞可能通过激活相关信号通路，进一步放大炎症和组织损伤。
氧化自身 DNA 激活 STING 信号通路促进 AKI 发展：研究表明，ox - 自身 DNA 刺激可使顺铂处理的小鼠肾脏组织中 STING 信号通路相关蛋白（如 pSTAT1、p-TBK1 和 p-IRF3）表达增加，同时促炎细胞因子（如 Ifn-β、Tnf-α 和 Il-6）的 mRNA 水平也显著升高。在体外实验中，ox - 自身 DNA 刺激骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）后，STING 信号通路相关蛋白表达和细胞因子分泌均明显增加。使用 Sting 基因敲除小鼠实验发现，敲除 Sting 基因可改善小鼠的生存情况并降低血清肌酐水平，但抑制 STING 通路对 AKI 的改善作用有限。相比之下，DNase I 治疗对 AKI 的改善效果更显著，这表明 ox - 自身 DNA 可能通过其他信号通路促进 AKI 进展。
氧化自身 DNA 诱导巨噬细胞焦亡促进 AKI 发展：研究发现，ox - 自身 DNA 处理的 BMDMs 中，细胞焦亡关键执行者 N - 末端成孔 GSDMD 片段（GSDMD-NT）水平显著增加，同时 IL-1β 和乳酸脱氢酶（LDH）释放增多，表明 ox - 自身 DNA 可诱导巨噬细胞焦亡。体内实验中，使用 GSDMD 抑制剂二硫仑或 NLRP3 信号通路抑制剂 MCC950 处理 AKI 小鼠，均可改善小鼠的生存情况并减轻肾小管损伤，这表明 NLRP3 炎性小体在 ox - 自身 DNA 促进 AKI 进展中起关键作用。
A20 是响应 ox - 自身 DNA 刺激的关键分子：通过 RNA 测序和 KEGG 通路分析，研究人员发现 ox-dsDNA90 或环状二核苷酸（CDNs）刺激 BMDMs 后，Tnfaip3（编码 A20）基因显著上调。进一步研究表明，A20 的表达高度依赖于 NF-κB 的调控，NF-κB 通路抑制剂 BAY11-7082 可几乎完全抑制 A20 的表达增加，而 STING 信号通路抑制剂 C-176 对 A20 表达的影响较小。
A20 抑制 ox - 自身 DNA 诱导的 STING 信号通路激活：利用 A20^myel-KO小鼠和过表达 A20 的细胞模型研究发现，A20^myel-KO巨噬细胞中 STING 信号通路相关蛋白表达升高，对 ox-dsDNA90 刺激更敏感，细胞因子表达和分泌增加；而过表达 A20 则可降低 STING 通路的激活，减少细胞因子的表达和分泌，表明 A20 能够抑制 ox - 自身 DNA 诱导的 STING 信号通路激活。
A20 抑制 ox - 自身 DNA 诱导的细胞焦亡并减轻 AKI 进展：实验表明，A20^myel-KO巨噬细胞在 ox-dsDNA90 或 LPS 加 ATP 刺激下，细胞焦亡相关蛋白和促炎细胞因子 IL-1β 表达增加，LDH 释放增多；而过表达 A20 的细胞则对这些刺激更具抗性，细胞焦亡减少，IL-1β 分泌降低，LDH 释放减少。在体内实验中，A20^myel-KO小鼠在诱导 AKI 后生存时间缩短，血清肌酐升高，肾小管损伤加重；而过表达 A20 则可改善 AKI 小鼠的生存情况，降低血清肌酐，减轻肾小管损伤。此外，预先给予低剂量 TNF-α 处理可增强细胞对细胞焦亡的抗性，改善 AKI 小鼠的病情，进一步证明 A20 在限制 ox - 自身 DNA 诱导的细胞焦亡和 STING 通路激活，从而减轻 AKI 方面发挥重要作用。
A20 通过破坏 NEK7 与 NLRP3 复合物的结合减轻 ox - 自身 DNA 介导的细胞焦亡：研究人员发现 A20 能够与 NEK7 结合，且在 ox-DNA 刺激下结合更明显。通过分子对接预测和实验验证，确定了 NEK7 上的 Lys140 是与 A20 和 P-II 结合的关键位点。突变 Lys140 可显著减弱 NEK7 与 A20 和 P-II 的结合，同时破坏 NEK7 与 NLRP3 复合物的结合，提示 A20 可能通过竞争性结合 NEK7，抑制 NEK7/NLRP3 / 细胞焦亡轴的激活。
干扰 NEK7 可减轻 AKI 进展：构建 Nek7^myel-KO小鼠并进行实验，发现敲除 NEK7 可改善 AKI 小鼠的生存时间和生存率，降低血清肌酐，减轻肾小管损伤和肾纤维化。使用 siRNA 敲低 NEK7 或给予 A20 衍生肽处理，也能得到类似的保护效果。此外，研究还发现，能够影响 NEK7 活性和表达的药物（如二甲双胍和黄连素），可减轻 AKI 小鼠的血清肌酐、肾小管损伤和肾纤维化，改善小鼠生存情况，表明 NEK7 是 AKI 治疗的有前景的靶点。

在研究结论与讨论部分，研究人员总结发现，A20 在限制自身 DNA 诱导的 NLRP3 炎性小体激活和细胞焦亡方面发挥着关键作用，进而减轻 AKI 的进展。在 AKI 患者和小鼠模型中，均检测到氧化自身 DNA 的释放增加，其激活了 STING 通路和 NLRP3 炎性小体。与抑制 STING 通路相比，靶向 NLRP3 / 细胞焦亡轴能更有效地改善 AKI 小鼠的生存时间和生存率。A20 被筛选鉴定为具有抗炎和抗细胞焦亡功能的自我限制分子，其衍生肽 P-II 对 NEK7 蛋白具有高亲和力，可干扰 NEK7 与 NLRP3 复合物的结合。研究还确定了 NEK7 上的 Lys140 在与 A20 和 NLRP3 结合中的关键作用。此外，通过构建 Nek7^myel-KO小鼠和使用针对 NEK7 的药物（如二甲双胍、黄连素和 A20 衍生肽）研究发现，降低 NEK7 的蛋白水平和活性可减轻 NLRP3 炎性小体介导的细胞焦亡，改善 AKI 小鼠的生存时间。因此，A20-NEK7 轴是 AKI 治疗的有前景的靶点。

这项研究为深入理解 AKI 的发病机制提供了新的视角，揭示了 A20 和 NEK7 在调节氧化自身 DNA 介导的炎症中的关键作用，为开发治疗 AKI 的新策略奠定了理论基础，有望为临床治疗带来新的突破，改善 AKI 患者的预后。