研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是样本采集，他们从悉尼脑库和新南威尔士脑组织资源中心获取了 22 例散发性 ALS 患者和 11 例神经健康对照者的死后新鲜冷冻脑组织样本。然后进行 RNA 测序（RNA-seq），对每个个体的 5 个脑区（运动皮层、前额叶皮层、海马体、枕叶皮层和小脑）进行 mRNA 测序。此外，还运用了多种生物信息学分析方法，如差异基因表达分析、细胞类型反卷积、差异转录本使用分析和可变剪接分析等，对测序数据进行深入挖掘。
下面来看看具体的研究结果：
- ALS 死后大脑 RNA-seq 队列：研究人员成功生成了 22 例散发性 ALS 患者和 11 例对照者的死后大脑 RNA-seq 数据，对 5 个脑区共 165 个样本进行研究。通过主成分分析（PCA），确认了脑区基因表达的分布符合预期1。
- 基因表达变化在 ALS 死后大脑中广泛存在：对 ALS 患者和对照者进行差异基因表达分析，发现 5 个脑区都有基因表达变化。小脑的差异表达基因数量最多，有 3337 个，且独特差异表达基因也最多，达 2007 个。同时，还发现一些基因在多个脑区都有差异表达，比如 VAPB 在多个脑区下调，BDNF 在所有脑区都显著下调2。
- 小脑在 ALS 患者中细胞类型组成可能改变：通过细胞类型反卷积分析，发现 ALS 患者小脑的神经元预计减少，而星形胶质细胞、少突胶质前体细胞和内皮细胞预计增加，不过部分结果在多重检验校正后不显著。使用不同参考数据集进行第二轮反卷积，也得到了类似结果3。
- 差异转录本使用事件涉及 UPR 激活和 TDP-43 功能障碍：研究发现 139 个基因在 ALS 患者和对照者之间存在转录本使用的显著变化。例如，在小脑的 POLDIP3 基因，其一个转录本的使用增加，该转录本的变化与 TDP-43 功能丧失有关；在运动皮层的 XBP1 基因，其 “剪接” 转录本使用增加，这涉及未折叠蛋白反应（UPR）的激活4。
- 在 ALS 大脑中发现广泛的 RNA 剪接变化，包括外显子跳跃和内含子保留：通过可变剪接分析，发现不同脑区有大量的局部剪接变化（LSVs），且许多基因的可变剪接事件是脑区特异性的。同时，还检测到与 TDP-43 核缺失相关的隐蔽剪接事件，如 STMN2 基因的隐蔽外显子在运动皮层显著增加5。
- 4 期 ALS 患者在小脑中具有独特的基因表达特征：比较不同 pTDP-43 病理分期的 ALS 患者，发现 4 期 ALS 患者小脑有 272 个基因与 1 - 3 期患者存在显著差异。对这些差异基因进行富集分析，发现其涉及代谢过程、炎症反应等多种生物学过程。蛋白质组学分析也发现，4 期 ALS 患者小脑有独特的蛋白质表达特征6。
在研究结论和讨论部分，研究人员发现 ALS 患者大脑存在广泛的 RNA 表达和剪接变化，小脑在其中的变化尤为突出，即使小脑很少出现 pTDP-43 病理，但仍有大量与 pTDP-43 病理阶段相关的 RNA 变化。这表明 ALS 是一种多系统神经退行性疾病，一些脑区可能比我们想象的更容易受到疾病影响。而且，研究还发现了与 TDP-43 功能障碍相关的异常剪接事件，这些事件不仅存在于有 pTDP-43 包涵体病理的脑区，也存在于其他脑区。这提示我们，TDP-43 功能障碍在 ALS 中的影响范围比之前认为的更广。此外，研究还发现不同脑区间存在保守的基因表达变化，这暗示可能存在一种上游的、全脑范围的病理机制，触发了这些区域的共同病理或代偿反应。不过，研究也存在一定的局限性，比如样本量相对较小，可能无法完全捕捉到 ALS 和对照人群的转录组多样性。但总体来说，这项研究为我们深入理解渐冻症的发病机制提供了重要线索，为未来开发更有效的治疗方法奠定了基础，也让我们看到了攻克渐冻症的新希望。
