在生命的起始篇章中，胚胎发育的表观遗传调控始终是解开哺乳动物演化谜题的关键钥匙。基于真兽类（如小鼠、人类）的研究已构建起 "全基因组 DNA 甲基化擦除是胚胎发育必需" 的理论框架，但这一机制是否普适于所有哺乳动物？有袋类作为与真兽类在 1.6 亿年前分道扬镳的古老类群，其胚胎发育具有胎盘形成晚、着床短暂、幼仔出生后完成发育等独特特征，为检验该理论的普适性提供了天然实验模型。然而，有袋类胚胎早期的表观基因组图谱，尤其是 DNA 甲基化这一关键表观遗传标记的动态变化，长期笼罩在科学的迷雾之中。解开这一谜团，不仅能填补哺乳动物表观遗传进化的拼图，更将为理解人类胚胎发育异常、印记疾病等提供跨物种的启示。
为此，英国弗朗西斯・克里克研究所（The Francis Crick Institute）的研究团队将目光聚焦于负鼠（Monodelphis domestica），通过高精度的甲基化测序技术，绘制了其配子、早期胚胎（从胚胎第 1.5 天到第 7.5 天）及成体组织的 DNA 甲基化图谱，首次系统揭示了有袋类胚胎发育中的甲基化动态规律，并与真兽类进行了跨物种比较。这项发表于《Nature》的研究，犹如一盏明灯，照亮了哺乳动物表观遗传多样性的隐秘角落。
研究采用了三大核心技术体系：
- 低输入亚硫酸氢盐测序（low-input BS-seq）：对微量的负鼠精子、卵母细胞、单个胚胎（包括囊胚阶段的内细胞团和滋养外胚层）及成体组织进行全基因组甲基化单碱基分辨率检测，捕获了 4.2%-83% 的 CpG 位点（≥5× 覆盖）。
- 单细胞多组学技术（single-cell multi-omics）：在囊胚阶段分离内细胞团（含上胚层和原始内胚层）与滋养外胚层，结合单细胞甲基组和转录组分析，解析不同细胞谱系的甲基化差异。
- 基因编辑与功能验证：通过 CRISPR 介导的 DNMT1 基因敲除，在负鼠成纤维细胞中探究 DNA 甲基化对 X 染色体失活相关非编码 RNA（RSX）的调控机制。
与真兽类受精后父源基因组主动去甲基化、早期胚胎全基因组低甲基化的模式截然不同，负鼠胚胎在卵裂阶段（直至第 4.5 天）始终维持高甲基化状态（平均 64%）。即使在囊胚阶段，上胚层的去甲基化仅为短暂且温和的（从 E5.5 的 54% 降至 E6.5 的 45%，随后回升至 E7.5 的 49%），而滋养外胚层则持续低甲基化，这与真兽类胎盘组织的甲基化特征相似，提示低甲基化在哺乳动物胎盘发育中可能具有进化保守功能。
负鼠精子与卵母细胞的甲基化差异（精子 77% vs 卵母细胞 65%）显著小于真兽类，且卵母细胞甲基化水平与成体体细胞接近。研究鉴定出 20,800 个精子特异性和 22,921 个卵母细胞特异性差异甲基化区域（DMRs），其中约半数在胚胎发育中短暂存在，85 个持续至成体组织，成为潜在的印记基因位点。值得注意的是，母源 DMRs 在成体中富集，与真兽类类似，提示印记机制在有袋类中的保守性。
在真兽类中，失活 X 染色体（Xi）的 CpG 岛启动子区通常高甲基化，而有袋类的 Xi 呈现全基因组低甲基化，这一特征在胚胎发育的囊胚阶段已清晰显现。进一步研究发现，负鼠 XCI 依赖于母源甲基化的 RSX（Xist 样非编码 RNA）启动子区域，敲除 DNMT1 导致 RSX 异常表达并引发 X 连锁基因沉默，揭示了 DNA 甲基化通过调控 RSX 介导印记 XCI 的新机制，与小鼠依赖 H3K27me3 的机制形成鲜明对比。
单细胞转录组分析显示，维持甲基转移酶 DNMT1A/B 及辅助因子 UHRF1 的表达在卵裂阶段高企，囊胚期在上胚层重新激活并伴随甲基化回升，而在滋养外胚层表达下调导致持续去甲基化。与之相对，TET 家族羟化酶表达水平极低，提示有袋类主要依赖 DNMTs 的动态表达而非主动去甲基化途径调控甲基化模式。
这项研究打破了以真兽类为中心的表观遗传认知范式，揭示了有袋类与真兽类在胚胎甲基化动态、XCI 机制及印记基因调控等方面的显著差异，证明 DNA 甲基化重编程在哺乳动物中经历了适应性进化。研究提出 "全基因组去甲基化可能是真兽类特化特征" 的新观点，并推测其与 Dppa3 基因的演化相关。此外，鉴定出的 marsupial 特异性印记基因及 RSX 介导的 XCI 机制，为研究哺乳动物性别决定、胎盘进化及印记疾病提供了宝贵资源。
从更宏观的视角看，该研究通过比较表观基因组学，为理解哺乳动物演化树的表观遗传分支提供了关键证据，同时为开发跨物种胚胎操作技术、保护濒危有袋类物种奠定了理论基础。正如研究团队指出，有袋类模型将成为解码表观遗传进化的核心工具，引领我们深入探索生命蓝图背后的遗传与环境互作密码。
