在绿色微藻生物技术领域，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)因其卓越的光合效率被视为理想的"绿色细胞工厂"。然而这个潜力巨大的生物制造平台却长期受困于一个致命缺陷——强烈的转基因沉默现象。当外源基因被导入莱茵衣藻细胞核后，这些基因往往会被"静音"，导致表达水平低下且不稳定。这种现象严重制约了微藻在可持续生物制造中的应用，使得许多设计精妙的代谢工程策略难以实现预期效果。
面对这一挑战，德国比勒菲尔德大学的研究团队在《TRENDS in Biotechnology》发表了一项突破性研究。他们采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，系统性地靶向敲除参与表观遗传沉默的关键因子，成功构建了多个转基因表达显著增强的莱茵衣藻突变株系。这些工程藻株不仅展现出前所未有的外源蛋白表达能力，更保持了出色的遗传稳定性，为微藻生物技术领域提供了革命性的研究工具和产业应用基础。
研究团队采用了多项关键技术：首先运用CRISPR/Cas9介导的基因编辑构建单基因敲除突变体；通过同源定向修复(HDR)策略引入筛选标记；建立基于NpuDnaE内含肽的split selectable marker系统实现多基因共编辑；采用荧光报告基因(mVenus-YFP)定量评估转基因表达效率；利用气相色谱(GC-FID)分析萜类化合物产量；通过qPCR监测转座子活性变化。
【CRISPR/Cas9介导的表观遗传因子破坏】研究团队首先筛选了16个潜在参与表观沉默的候选基因，包括组蛋白甲基转移酶(HLMs)、DNA甲基转移酶(DMCs)、去乙酰化酶(SRTs)等。通过设计特异性sgRNA和修复模板，成功构建了11个基因的单敲除突变体。荧光报告系统显示，△DMC5、△SRTA、△VIG1和△MUT9突变体的转基因表达分别比野生型提高了80%、58%、57%和57%，其中△DMC5表现最为突出。
【转基因表达的长期稳定性】长达3个月的追踪研究发现，△HLM4、△DMC5和△VIG1单敲除株系不仅初始表达量高，而且完全避免了常见的转基因沉默现象。相比之下，广泛使用的UVM4工业菌株虽然初始表达量较高，但3个月内表达水平下降了16%。这表明靶向破坏维持型表观修饰因子(如DNA甲基转移酶DMC5和组蛋白甲基转移酶HLM4)能有效阻断沉默信号的代际传递。
【系统组合有益敲除】研究人员将效果显著的单敲除进行组合，构建了9个双敲除和7个三敲除株系。所有组合株系均显著超越野生型，其中△A51(△SRTA+△DMC5+△VIG1)表现最优，不仅mVenus表达量提高2.3倍，在萜类合成应用中更是展现出惊人潜力。该株系生产的α-蒎烯达到30 mg/L，比对照提高近5倍。
【高效转化株筛选】统计分析显示，三敲除株系中高效表达转化体的比例比野生型提高10倍以上，比UVM4提高2倍。这意味着研究者可以大幅减少筛选工作量，从每288个转化体中平均获得8.3个高效表达克隆，极大提升了工程藻株构建效率。
【萜类生物合成验证】为验证实际应用价值，研究团队在△A51中表达了4种萜类合成酶。结果显示，不仅荧光报告基因表达稳定，所有目标产物产量均显著提升：α-蒎烯(30 mg/L)、广藿香醇(11.7 mg/L)、蓖麻烯(20.3 mg/L)和紫杉二烯(13.5 mg/L)。这些数据充分证明了工程藻株在生物制造中的实用价值。
【分裂筛选标记系统】为减少抗生素抗性基因的使用，团队创新性地将Nostoc punctiforme DnaE内含肽(NpuDnaE intein)应用于莱茵衣藻。他们将壮观霉素抗性基因(SpecR)分割为两部分，分别与内含肽片段融合，通过蛋白质反式剪接恢复功能。三种分割方案(SP119、SP132、SP196)均成功实现基因编辑，其中SP119效率达到完整基因的26.1%。该系统被成功用于重建△A51三敲除株系，仅使用一个筛选标记就实现了两个基因的共编辑。
这项研究在理论和应用层面均取得重要突破。在基础研究方面，27个表观突变株为揭示微藻基因沉默机制提供了宝贵资源，特别是首次明确了DMC5和HLM4在维持转基因沉默中的关键作用。应用层面，△A51等高性能株系解决了长期制约微藻生物技术的表达瓶颈，使萜类等高价化合物的大规模生产成为可能。创新的split selectable marker系统则为复杂遗传操作提供了新工具。
值得注意的是，研究还发现表观修饰存在明显的功能冗余。虽然靶向11个基因均能影响转基因表达，但仍有5个基因(如HLM3、EZH等)未能获得敲除株系，提示这些基因可能参与必需生命活动。此外，工程藻株在保持强大转基因表达能力的同时，未出现明显的生长缺陷或转座子激活现象，说明表观调控网络具有显著的可塑性。
这项研究将微藻生物技术的成熟度(TRL)提升至4级，为后续产业化开发奠定了基础。随着更多表观调控因子的发现和编辑，未来有望构建完全解除转基因沉默的"超级表达"藻株，使微藻真正成为绿色制造的通用底盘。该成果不仅对藻类生物技术具有里程碑意义，其揭示的表观遗传规律也为其他真核生物的基因表达调控研究提供了重要参考。
