在真核细胞的蛋白质质量控制系统中，70 kDa热休克蛋白(Hsp70)家族扮演着核心角色，其中内质网中的免疫球蛋白结合蛋白(BiP)是维持"细胞折叠工厂"稳态的关键分子伴侣。尽管已知Hsp70通过ATP水解循环驱动其功能，但长期以来科学家们面临两大技术瓶颈：传统方法只能孤立测量单个反应步骤，且缺乏在功能循环过程中同时获取结构信息的工具。这导致对Hsp70变构调控机制的理解始终存在空白，特别是核苷酸转换与产物释放的精确时序如何影响其作为foldase（折叠酶）、holdase（持留酶）等多重功能。
为解决这一挑战，瑞士巴塞尔大学的研究团队开发了突破性的"in-cyclo NMR"技术，通过整合高灵敏度甲基核磁共振与酶耦联的ATP再生系统，首次实现了人类BiP NBD在完整ATP水解循环中的实时观测。相关成果发表在《Nature Communications》上，揭示了分子伴侣机器的精密工作机制。
研究采用三项关键技术：甲基特异性同位素标记的核磁共振谱学（解析蛋白构象变化）、ATP再生/磷酸清除酶耦联系统（维持稳态循环）、交换光谱(EXSY)与单周转实验（验证动力学参数）。通过优化蛋白纯化流程获得>98%纯度的样品，利用13C-1H甲基TROSY技术实现了102个甲基信号的完整归属，为动态监测奠定结构基础。
【NMR共振归属揭示构象指纹】
研究首先建立了BiP NBD在四种状态（apo、Pi结合、ADP·Pi结合、ADP结合）的甲基化学位移指纹图谱。通过突变体筛选和NOESY网络分析，成功归属了84个甲基信号（包括32/35缬氨酸和22/25异亮氨酸），其中V50γ1、I52δ1等残基的化学位移变化成为监测核苷酸状态转换的关键报告因子。
【原位捕获ATP结合态】
创新性的ATP再生系统使研究者首次观测到传统方法无法稳定的ATP结合态（T态），其核磁信号既不同于apo状态，也区别于ADP·Pi结合态（D·Pi态）。结构分析显示ATP结合主要引起核苷酸结合裂隙和lobe IA的结构重排，而常用ATP类似物AMPPNP等未能真实模拟天然ATP诱导的构象变化。
【双通路产物释放机制】
定量分析显示功能循环中T态（36%）、D·Pi态（44.6%）和D态（19.4%）的分布比例，对应平均驻留时间分别为15s、18s和8s。动力学拟合揭示ADP·Pi通过两条平行途径释放：磷酸优先解离（koff4=0.047 s-1）或ADP优先解离（koff5=0.019 s-1），且两条通路在生理条件下均被使用。单周转实验验证水解速率kcat=0.065 s-1，MABA-ADP释放实验证实ADP解离参数准确性。
【代谢物浓度的调控作用】
模拟生理环境发现：当ADP浓度从1 mM升至3 mM且磷酸达5 mM时，D·Pi态驻留时间延长18倍，整个循环周期延长8倍。这表明ADP/磷酸浓度波动可作为内质网应激时的天然调节器，通过延长产物复合物存留时间调控客户蛋白接触时长。
【钙离子的非典型调控】
尽管钙离子能结合ADP-bound NBD（KDCa=212 μM），但在功能循环中仅当ADP累积且磷酸缺乏时形成NBD·ADP·Ca2+ off-cycle状态。生理条件下（[Pi]>0.5 mM），钙离子对循环动力学无显著影响，这一发现修正了传统认知。
该研究通过建立"in-cyclo NMR"技术平台，首次完整描绘了Hsp70分子伴侣的ATP水解能量景观（图6）：从ATP结合态（15s）经不可逆水解（kcat）到ADP·Pi态（18s），再通过双通路释放进入新循环。这一突破不仅解决了领域内长期存在的技术难题，更揭示了环境代谢物通过调控产物释放速率来精细调节Hsp70功能的分子原理。特别值得注意的是，研究发现钙离子需要与ADP协同才能影响循环，这种条件依赖性调控模式为理解内质网应激响应提供了新视角。未来该技术平台可延伸至全长Hsp70及其与辅伴侣（如J-domain蛋白）的复合体系研究，为开发针对癌症、神经退行性疾病等Hsp70相关疾病的靶向药物奠定理论基础。
