随着全球气候变暖加剧，高温胁迫已成为威胁葡萄产业可持续发展的重大挑战。作为全球最重要的水果作物之一，葡萄（Vitis vinifera）在高温下常表现为芽分化弱、叶片薄、果实风味差等问题，而目前对葡萄热耐受性遗传基础的认知仍十分有限。尽管已有研究克隆了VvHSFA2、VpHSF1等部分热响应基因，但其功能验证多局限于拟南芥等模式植物，且缺乏对自然种群适应性差异的机制解析。
为破解这一难题，中国科学院的研究团队通过整合121个葡萄种质资源的GWAS分析与耐热/敏感品种（V. davidii 'Tangwei'和V. vinifera 'Jingxiu'）的转录组数据，锁定4号染色体上WRKY转录因子基因TTC4（Thermotolerance on Chromosome 4）为关键调控因子。研究发现TTC4通过直接激活热休克蛋白HSP18.1和抗氧化物酶APX3的表达正向调控热耐受性，而其内含子2的SNP-T/C(7631)变异通过改变GTAC/GTAT元件与抑制因子SPL13的结合能力，形成"抑制-去抑制"的精细调控网络。该研究首次揭示了内含子区自然变异通过转录因子结合差异驱动葡萄种群热适应性分化的分子机制，为作物抗逆育种提供了全新策略，相关成果发表于《Nature Communications》。
研究团队运用多组学联合作战：基于121个葡萄种质资源的重测序数据开展GWAS定位；通过DAP-seq（DNA亲和纯化测序）全基因组筛选TTC4靶基因；利用酵母单杂交（Y1H）和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证蛋白-DNA互作；构建双荧光素酶报告系统解析内含子增强子功能；通过瞬时过表达/RNA干扰在葡萄植株和悬浮细胞系中进行功能验证。
主要研究结果
TTC4的鉴定与功能验证
通过比较耐热型野生葡萄与敏感型栽培种的转录组特征，结合GWAS信号峰值分析，锁定VIT_204s0023g00470（命名为TTC4）为核心候选基因。在葡萄悬浮细胞中过表达TTC4可使细胞存活率提高2.1倍，而RNA干扰沉默导致电解质泄漏率增加37%。
分子调控机制解析
DAP-seq揭示TTC4结合靶基因启动子区W-box（TGAC）元件，其中HSP18.1和APX3富集度最高。EMSA证实TTC4TW和TTC4JX均能结合HSP18.1启动子P2-4区段，双荧光素酶实验显示其转录激活能力提升4.8倍。
内含子变异的调控奥秘
内含子2的SNP-T/C(7631)位于GTAC元件，酵母单杂交发现SPL13特异性结合TTC4C(7631)变体而非TTC4T(7631)。双荧光素酶证实SPL13可使TTC4C(7631)表达降低62%，但对TTC4T(7631)无影响。
自然种群适应性分析
单倍型网络显示野生葡萄中TTC4T(7631)单倍型占比达68%，显著高于栽培种（29%）。三个独立群体验证显示T/T基因型材料Fv/Fm值比C/C型高22%-35%，证实该SNP与表型高度关联。
这项研究不仅首次阐明WRKY转录因子通过HSP-抗氧化酶双通路调控葡萄热耐受性的分子机制，更创新性地发现内含子区SNP通过调控抑制因子结合能力驱动自然种群适应性分化。TTC4T(7631)单倍型作为宝贵的遗传资源，为培育抗高温葡萄品种提供了分子标记和靶向编辑策略，对应对气候变化下的作物稳产具有重要意义。研究揭示的"内含子增强子-转录抑制"调控模式，为植物非编码区功能研究开辟了新视角。
